小分子的高效液相色谱 (HPLC)、超高效液相色谱 (UHPLC) 或液相色谱-质谱 (LC-MS) 分析能否获得最佳结果，取决于选择最合适的固定相和流动相条件。分析物的化学成分是选择最合适的色谱柱化学成分的关键。速度、样品基质和化合物数量等其他方面决定了固定相的最佳基质材料。

小分子的高效液相色谱分析通常采用反相分离模式。亲水相互作用色谱（HILIC）和正相色谱也适用于极性化合物的分离，其中亲水相互作用色谱是首选方法。离子化合物的分离可采用离子交换分离模式，无机阴离子或阳离子的分离也可采用离子色谱法。

高效液相色谱柱由全孔二氧化硅颗粒、表面多孔二氧化硅颗粒、聚合物颗粒填充，或由 monolithic silica 棒作为固定相。此外，还使用氧化铝、氧化锆颗粒和碳颗粒。用于小分子分离的固定相材料的典型孔径范围为 60 Å - 160 Å。对于高效液相色谱法，固定相的典型粒径范围为 3 µm 至 5 µm，而对于超高效液相色谱法，则使用更小的粒径，通常为 2 µm 或更小。固定相上可附加不同的色谱柱选择性（改性）。C18 烷基链是反相 (RP) 色谱中最常用的色谱柱化学结构。不过，其他改性，如 C30、C8、苯基、五氟苯基和各种极性更强的改性，以及具有离子交换或手性特性的改性，也能分离几乎所有可溶于液体的化合物。RP-HPLC 的流动相通常由水性缓冲液或水以及乙腈或甲醇等水溶性有机溶剂组成。